Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Forschungsbericht Berichtszeitraum:01.01.1995 - 31.12.1996

Fachbereich Biologie

Institut für Mikrobiologie

Projekte

 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Ute Lechner
 Thema: Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung des Chlorphenolabbaus durch aerobe Bakterien
 Kurzbeschreibung: Aus Belebtschlamm einer Industriekläranlage isolierte Bakterienstämme mit einem hohen Abbaupotential für chlorierte Phenole erwiesen sich als nicht identisch mit bekannten Arten.Taxonomische Untersuchungen wie die Sequenzierung der 16S-rDNA erlaubten eine phylogenetische Zuordnung in die a-Untergruppe der Proteobakterien und unterstreichen das bisher unterschätzte degradative Potential dieser Bakteriengruppe. Einige Gene für die Enzyme des Abbauweges wurden kloniert und sequenziert und eine Ähnlichkeit von 40 bis 73 % wurde zu bekannten Enzymen anderer Bakterien auf der Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenzen festgestellt. Die initiale 2,4-Dichlorphenolhydroxylase wurde aus dem Bakterium isoliert und charakterisiert. Die N-terminale Sequenz weist das konservierte FAD-Bindemotiv von Flavoproteinen auf.
 Finanzierung: Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt
 Laufzeit: 1993 bis 1996

 Projektleiter: Dr. Ute Lechner, Prof. Dr. Jan R. Andreesen
 Thema: Reduktive Dechlorierung von Chloraromaten durch anaerobe Bakterien
 Kurzbeschreibung: Hochchlorierte aromatische Verbindungen sind durch eine hohe Persistenz in der Umwelt gekennzeichnet. Für einige Verbindungen ist die reduktive Dechlorierung durch anaerobe Bakterien der einizige bisher bekannte biologische Abbaumechanismus. Aus Sedimenten der Saale wurden anaerobe Konsortien angereichert und charakterisiert, die verschiedene Chloraromaten (Chlorphenole, Chlorbrenzkatechine und Chlordibenzo-p-dioxine) reduktiv dechlorieren können. Die Befähigung einer hoch angereicherten Mischkultur zum Wachstum mit Formiat als Elektronendonator und 2,4,6-Trichlorphenol als Elektronenakzeptor deuten auf die Nutzung der Chlor-Respiration als energiekonservierende Reaktion hin. Die Zusammensetzung der Mischkultur (Desulfitobacterium frappieri, Clostridium hydroxybenzoicum u. a.) wurde durch molekulare Techniken (Restriktionsmuster amplifizierter 16S-rDNA, Sequenzierung der 16S-rDNA-Gene von isolierten Einzelkolonien) ermittelt. Anhand ausgewählter Kongenere wurden die Dechlorierungswege für polychlorierte Dibenzo-p-dioxine aufgeklärt und Unterschiede zwischen Anreicherung aus der Saale und Mulde aufgezeigt. Erste Charakterisierungen der Mischpolulationen ergaben, daß methanogene Baktrien nicht am Dechlorierungsprozeß beteiligt sind.
 Finanzierung: BMFT-Projekt, DAAD, Graduiertenförderung
 Laufzeit: 1993 bis 1996, 1996 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Brigitte Söhling
 Thema: Neuartige Katalysemechanismen redoxaktiver Proteine bei der Reduktion von Glycin, Sarcosin und Betain in anaeroben Mikroorganismen
 Kurzbeschreibung: Im Rahmen des Projekts wird die reduktive Desaminierung von Glycin bzw. den N-Methylderivaten Sarcosin und Betain durch Eubacterium acidaminophilum und andere anaerobe Mikroorganismen Clostridium litorale, C. sporogenes, C. sticklandii) untersucht. Diese Reaktion wird durch eine redoxaktive Interaktion mehrerer Proteinkomplexe katalysiert, an der verschiedene Thiol- bzw.Selenogruppen beteiligt sind (Proteine A, B, C des Reduktase-Systems, Thioredoxin, Thioredoxin-Reduktase). Nach Bindung des Substrats durch Selenoprotein B (für Glycin und Sarcosin wird eine proteingebundene Carbonylgruppe, vermutlich ein Pyruvoylrest, postuliert) und Desaminierung kommt es dann zur Übertragung (bzw. Bildung) eines Carboxylmethylselenoethers an Selenoprotein A. Anschließend erfolgt die Dehydratisierung des Carboxymethylselenoethers zum enzymgebundenen Acetylthioesters (Protein C), der durch weitere Umsetzung über die Zwischenstufe Acetylphosphat zur Energiekonservierung genutzt werden kann. Die Reduktionsäquivalente werden von einem Thioredoxin-System bereitgestellt, das besonders hinsichtlich der Thioredoxin-Komponente starke Abweichungen von den bisher gültigen Consensus-Sequenzen aufweist. Die Arbeiten umfassen die biochemische Charakterisierung der Reaktion und der an ihr beteiligten Proteine sowie die molekularbiologische Analyse der zugehörigen Genregionen aus verschiedenen anaeroben Mikroorganismen. Funktionelle Aminosäuren werden durch vergleichende Analyse der Genprodukte aus verschiedenen Organismen identifiziert bzw. durch gezielte Mutagenese charakterisiert. Darüber hinaus werden Untersuchungen zur Expression der Gene bzw. zur Prozessierung des Proproteins durchgeführt.
 Finanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft
 Laufzeit: 1992 bis 1998


 Projektleiter: Dr.rer.nat. Brigitte Söhling, Prof. Dr. Jan R. Andreesen
 Thema: Einbau von Selenocystein in Proteine anaerober, Gram-positiver Bakterien
 Kurzbeschreibung: Anaerobe aminosäureverwertende Mikroorganismen wie Eubacterium acidaminophilum, Clostridium litorale, C. sporogenes, C. sticklandii verwenden zur Reduktion ihrer Substrate ungewöhnliche Enzymsysteme, die z. T. mehrere Selenocystein-haltige Proteine enthalten. Wie in anderen Pro- und Eukaryonten läßt sich dem Selenocystein-Rest in den entsprechenden Genen ein UGA-Codon zuordnen, das normalerweise einen Translationsstop bewirkt. Die bisherigen Untersuchungen zum Einbau von Selenocystein in bakterielle Proteine erfolgten hauptsächlich an dem Selenoprotein Formiat-Dehydrogenase (FdhH, FdhN) in E. coli: Selen wird chemisch zu Selenid reduziert, das durch das SelD-Protein zunächst zum Selenophosphat aktiviert und dann (katalysiert durch die Selenocystein-Synthase, SelA) auf die mit Serin beladene tRNA (selC) übertragen wird. Der Einbau in die Proteinkette am Ribosom erfolgt mittels eines spezifischen Elongationsfaktors (SelB). Die Differenzierung zwischen einem Abbruch der Translation und dem Einbau von Selenocystein wird durch eine spezifische Sekundärstruktur der fdhH (bzw. fdhN)-mRNA möglich, die von SelB erkannt wird. Im Rahmen des beantragten Projektes sollen Untersuchungen zum Einbau von Selen in Gram-positiven anaeroben Organismen durchgeführt werden. Da diese Bakterien mehrere Selenocystein-haltige Enzyme besitzen, die z. T. auch in mehreren Genkopien vorliegen, könnte hier ein modifizierter Decodierungsmechanismus für UGA realisiert sein, zumal die bisherigen Erkennungsstrukturen nicht gefunden werden konnten. Die Arbeiten umfassen die Isolierung und Charakterisierung der für den Selenocysteineinbau notwendigen Gene aus verschiedenen Anaerobiern, Untersuchungen zur Protein-tRNA- und Protein-mRNA-Interaktion sowie Experimente zu einer möglichen heterologen Expression von Selenocystein-haltigen Genen in E. coli.
 Finanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (beantragt)
 Laufzeit: 1997 bis 2000


 Projektleiter: Dr.rer.nat. Andreas Pich, Prof. Dr. Jan R. Andreesen
 Thema: Charakterisierung und Regulation des Prolinstoffwechsels in anaeroben Bakterien
 Kurzbeschreibung: Der Anaerobier Clostridium sticklandii vergärt Aminosäuren im Rahmen einer Stickland-Reaktion und nutzt dabei Prolin und Glycin als Elektronenakzeptoren. Obwohl die Reduktion vom Glycin zum Acetat mit Energiekonservierung gekoppelt ist, wird Prolin bevorzugt von diesem Organismus zum d-Aminovalerat reduziert. In unserer Arbeitsgruppe wird daher der Prolinstoffwechsel eingehend untersucht. Die D-Prolin-Reduktase konnte gereinigt und biochemisch charakterisiert werden. Sie besteht aus 3 Untereinheiten (23, 26 und 45 kDa) und hat als Dekamer eine molekulare Masse von 850 kDa. Weiterhin konnte eine Prolin-Dehydrogenase / Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase, die wahrscheinlich den Prolin- mit dem Glutamat- und Ornithinstoffwechsel verbindet, gereinigt und das dazugehörende Gen kloniert werden. Untersuchungen, die die Präferenz von C. sticklandii für Prolin erklären, werden derzeit durchgeführt und die beteiligten Regulationsmechanismen sollen aufgeklärt werden.
 Finanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft
 Laufzeit: 1994 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Andreas Pich
 Thema: Wolframat-Aufnahme Gram-positiven anaeroben Bakterien
 Kurzbeschreibung: Erst seit kurzer Zeit ist bekannt, daß das Schwermetall Wolfram als positives Bioelement von anaeroben Bakterien verwendet und als Cofaktor in einige Enzyme eingebaut wird. Das Aminosäuren vergärende Bakterium Eubacterium acidaminophilum nutzt Wolfram in den Enzymen Formiat Dehydrogenase und Aldehyd Dehydrogenase. Die Aufnahme von Wolframat war bislang noch nicht untersucht. Der Transport von Wolframat in E. acidaminophilum erfolgt sehr spezifisch und wird nicht durch Molybdat beeinflußt. Die für dieses Aufnahmesystem codierenden Gene werden z. Z. in unserer Arbeitsgruppe isoliert, indem die möglicherweise enge Verwandtschaft zwischen Wolframat und Molybdat ausgenutzt werden soll. Eine nähere Charakterisierung des Transportsystems wird sich anschließen.
 Finanzierung: Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt
 Laufzeit: 1995 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Marion Moldenhauer
 Thema: Untersuchungen zum Abbau von Mucin durch Arten der Gattung Peptostreptococcus
 Kurzbeschreibung: Die Fermentation von Mucin, ein komplexes polymeres Glycoprotein, durch bekannte Arten der Gattung Peptostreptococcus stellt das Ziel dieses Projektes dar, wobei besonders der Abbau der Aminozuckerkomponenten interessiert. Bei den Peptostreptococcen handelt es sich um grampositive, anaerobe Bakterien, die u.a. im Gastrointestinaltrakt des Menschen zu finden sind. Phylogenetisch werden sie hauptsächlich dem Cluster XIII der Clostridien zugerechnet. Eine Verwertung von Mucin als Bestandteil der Schleimhäute könnte auf eine pathogene Wirkung dieser Stämme hindeuten. Dabei kommt dem Angriff auf die Kohlenhydratseitenketten des Mucins eine große Bedeutung zu. Bislang galten fast alle Arten als asaccharolytisch. Es konnte von uns gezeigt werden, daß vor allem Galactosamin und Galactose verstoffwechselt werden. Erste Untersuchungen hinsichtlich vorhandener Glucosidasen weisen ebenfalls auf einen Abbau hin.
 Finanzierung: Haushalt
 Laufzeit: 1996 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder
 Thema: Untersuchungen zum mikrobiellen Abbau von Morpholin
 Kurzbeschreibung: Morpholin wird in der chemischen Industrie in großen Mengen als Synthesebaustein, Lösungsmittel oder Additiv eingesetzt. Über die Abwässer kommt es durch die hohe Wasserlöslichkeit zu einem starken Eintrag in die Umwelt. Obwohl Morpholin als sekundäres Amin leicht zum entsprechenden Nitrosamin mit carcinogener Wirkung umgewandelt wird, ist über die biologische Abbaubarkeit bisher wenig bekannt. In unserer Arbeitsgruppe konnte ein als Mycobacterium aurum identifiziertes Bakterium in Reinkultur isoliert werden, das in der Lage war, Morpholin als alleinige C-, N- und Energiequelle zu nutzen. Der Organismus baut das Substrat vollständig ab und toleriert Konzentrationen bis zu 100 mM. Damit besitzt er zwei wesentliche Voraussetzungen für einen in situ Einsatz. Durch die Mineralisierung von Morpholin kommt es zur Anhäufung von NH4+-Ionen im Medium, die zu einer Wachstumshemmung führen. Es konnte gezeigt werden, daß der Organismus beim Wachstum auf Morpholin eine Alanin Dehydrogenase induziert, die möglicherweise für die Entgiftung der NH4-Ionen benötigt wird. Das Enzym wurde bis zur Homogenität gereinigt und eingehend charakterisiert.
 Finanzierung: DECHEMA
 Laufzeit: 1994 bis 1996


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder
 Thema: Vergleich initialer Oxygenasen des Pyrrol-2-carboxylat-Abbaus
 Kurzbeschreibung: Im Gegensatz zu anderen aromatischen, heterocyclischen Verbindungen, deren Abbau gewöhnlich durch molybdänhaltige Dehydrogenasen eingeleitet wird, konnte das entsprechende Enzym des Pyrrol-2-carboxylat Abbaus bei einem Arthrobacter Stamm als flavinabhängige Einkomponenten Monooxygenase identifiziert werden. Vergleiche mit verschiedenen Bakterienarten, die Pyrrol-2-carboxylat ebenfalls als C-N- und Energiequelle nutzen, ergaben, daß die jeweils vorhandenen Oxygenasen signifikante strukturelle Unterschiede aufweisen. Durch die Isolierung und Charakterisierung der Pyrrol-2-carboxylat Monooxygenase aus Rhodococcus sp. konnte gezeigt werden, daß dieser Organismus ein flavinabhäniges Zweikomponenten Enzym exprimiert, das aus einer Reduktase-Komponente und einer Oxygenase-Komponente besteht. Aufgrund der katalytischen und strukturellen Eigenschaften sowie durch Sequenzvergleiche wurde das Enzym der neuen Klasse von flavinabhängigen Zweikomponenten Monooxygenasen zugeordnet.
 Finanzierung: DECHEMA
 Laufzeit: 1994 bis 1996


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder
 Thema: Physiologie, Biochemie und Molekularbiologie des mikrobiellen Abbaus von Tetrahydrofuran und Tetrahydrofurfurylalkohol
 Kurzbeschreibung: Die cyclischen Ether Tetrahydrofuran (THF) und Tetrahydrofurfurylalkohol (THFA) sind in der chemischen Industrie sehr weit verbreitete Lösungsmittel und werden über die Abwässer in hohen Konzentrationen in die Umwelt entlassen. Aufgrund des Lösungsmittelcharakters dieser Verbindungen konnten bisher nur wenige Mikroorganismen isoliert werden, die ein Abbaupotential besaßen. Die maximal tolerierten Substratkonzentrationen lagen bei 5 - 10 mM. Bei einem von uns durchgeführten Screening mit THF als alleiniger C- und Energiequelle konnte ein den Steptomyceten zuzuordnender Organismus in Reinkultur isoliert werden. Dieses Bakterium ist in der Lage, THF vollständig zu mineralisieren und toleriert Konzentrationen bis zu 50 mM. Die Voraussetzungen für einen geplanten in situ Einsatz sind damit erfüllt. Weiterhin soll die Biochemie des Abbaus, die bisher nicht beschrieben wurde, eingehend untersucht werden. Die Aktivität der wahrscheinlichen, einleitenden Oxygenase scheint sehr labil zu sein. Untersuchungen zum THFA Abbau führten zur Isolierung einer als Ralstonia eutropha indentifizierten Reinkultur, die das Substrat vollständig mineralisiert und Konzentrationen bis zu 200 mM toleriert. Der einleitende Schritt des Abbaus ist eine Oxidation der Alkoholgruppe zur Carboxylgruppe und wird von einer PQQ-abhängigen Alkohol Dehydrogenase katalysiert. Das Enzym wurde bis zur Homogenität gereinigt und charakterisiert. Aufgrund seiner Eigenschaften konnte es der Klasse der Einkomponenten Quinohaemoproteine zugeordnet werden. Weitere Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Bildung eines CoA-Esters der nächste Schritt des Substratabbaus ist. Geplant ist neben dem in situ Einsatz des Organismus die biochemische und molekularbiologische Untersuchung des gesamten Abbauweges.
 Finanzierung: Land Sachsen-Anhalt, Stipendium
 Laufzeit: 1994 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder
 Thema: Isolierung und Charakterisierung einer mikrobiellen Nikotinsäure-2-Hydroxylase
 Kurzbeschreibung: Der mikrobielle Abbau von Nikotinsäure wird in allen bisher beschriebenen Fällen durch eine sauerstoffunabhängige Hydroxylierung in Position 6 eingeleitet. Diese Reaktion wird von molybdänabhängigen Dehydrogenasen katalysiert, die eine a2b2c2-Struktur besitzen. Ein Screening auf Mikroorganismen, die in der Lage waren, 6-Methylnikotinsäure als C-N- und Energiequelle zu nutzen, führte zur Isolierung einer Reinkultur, bei der durch die Blockierung der Position 6 der einleitende Hydroxylierungsschritt an einer anderen Position erfolgen muß. Die Isolierung des initialen Enzyms ergab, daß es sich hier ebenfalls um eine molybdänhaltige Dehydrogenase mit bekanner Struktur und den typischen Cofaktoren handelt. Die von diesem Enzym katalysierte Hydroxylierung erfolgt nicht in Position 6, sondern in Nachbarstellung zur Carboxylgruppe in Position 2. Das Produkt dieser Reaktion, 2-Hydroxynikotinsäure besitzt aus biotechnologischer Sicht eine besondere Relevanz als "building block" für die Synthese unterschiedlicher Feinchemikalien.
 Finanzierung: Industriepartner
 Laufzeit: 1996 bis 1997


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder
 Thema: Bakterielle Biotransformation von Chinolonferivaten
 Kurzbeschreibung: Chinolon-Derivate sind als Hemmstoffe der baktriellen Gyrase eine relativ neue Klasse hochwirksamer Antibiotika. Über ihre biologische Abbaubarkeit ist dementsprechend wenig bekannt. Die Zulassung neuer Antibiotika setzt einen Nachweis ihrer Abbaubarkeit voraus. Im Rahmen des Projekts wurden unterschiedliche Chinolon-Derivate sowie einzelne Komponenten dieser Derivate auf ihre Abbaubarkeit durch Bakterien untersucht. Die Anreicherungsmedien enthielten die entsprechenden Substrate sowohl als alleinige C- und Energiequelle als auch als Cosubstrate. Bedingt durch die antibiotische Wirkung war es nur in wenigen Fällen möglich, Kulturen zu isolieren, die ein konstantes Wachstum auf den Substraten zeigten.
 Finanzierung: Industriepartner
 Laufzeit: 1995 bis 1996


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Dietrich H. Nies
 Thema: Architektur und Metalltransport bei einem baktriellen Kationen-Protonen-Antiporter
 Kurzbeschreibung: Ein Gram-negatives Bodenbakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, vermag sich auch in stark mit Schwermetallen belasteten Böden gut zu vermehren. Das Bakterium entgiftet Metalle wie die Ionen von Zink, Kobalt, Cadmium und Nickel durch Export. Eine membrangebundene Efflux-Pumpe transportiert sie über die gesamte Zellhülle hinweg nach außen. Die Struktur dieser Pumpe wurde für den CzcCBA-Komplex, der Co(II), Zn(II) und Cd(II) transportiert, durch Fusionen mit Reportergenen und biochemische Verfahren grob charakterisiert. So bewerkstelligt die CzcA-Untereinheit einen protonengetriebenen Transport über die Cytoplasma-Membran, dann überbrückt die CzcB-Untereinheit den periplasmatischen Raum und schließlich hilft CzcC beim Durchtritt durch die äußere Membran. Für die Substrat-Bindung wurde lange ein doppelt vorhandenes Histidin-reiches Motiv im CzcB-Protein favorisiert, da CzcB speziell für den effektiven Zink-transport essentiell ist, Zink mit einem Hill-Koeffizienten von zwei transportiert wird und besagtes Motiv in anderen, mit CzcB verwandten Proteinen, die z. B. Nickel und Kobalt transportieren, nicht vorhanden ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß die Motive zwar in den Zink-Export involviert sind, jedoch nicht für diesen essentiell sind. Um die Role der drei Untereinheiten bei der Substrat-Spezifität besser zu verstehen, werden gerade unterschiedliche CBA-Komplex, so die von Czc (Kobalt, Zink und Cadmium), Cnr (Kobalt und Nickel), Ncc (Kobalt, Nickel und Cadmium), Sil (Silber) und zwei Transporter unbekannter Spezifität aus E. coli und Synechocystis kombiniert. Erste Hybridkomplexe, bei denen die CB-Untereinheiten von Czc, Cnr und Ncc mit allen jeweiligen A-Untereinheiten kombiniert wurden, werden gerade untersucht.
 Finanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft
 Laufzeit: 1996 bis 1997, Verlängerung


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Dietrich H. Nies
 Thema: Regulation der Schwermetall-Homöostase in Alcaligenes eutrophus
 Kurzbeschreibung: Ein Gram-nagatives Bodenbakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, vermag sich auch in stark mit Schwermetallen belasteten Böden gut zu vermehren. Das Bakterium entgiftete Metalle wie die Ionen von Zink, Kobalt, Cadmium und Nickel durch Export. Eine membrangebundene Efflux-Pumpe transportiert sie über die gesamte Zellhülle hinweg nach außen. Da besagte Metall-Ion aber auch essentielle Spurenelemente für dieses Bakterium sind, muß ihr Export streng reguliert werden. Die Gene, die die Untereinheiten für die CzcCBA-Effluxpumpe kodieren, werden daher von Genen für regulatorische Proteine eingerahmt. Von drei Proteinen, CzcN, Czcl und Orf69a, kennen wir die Funktion noch nicht, für die der drei anderen (CzcD, CzcS und CzcR) liegen erste Ergebnisse vor. Alle neun Gene werden durch Metalle auf der Ebene der Transkription reguliert, die Größen der mRNAs und ihre Anfänge wurden im letzten Jahr bestimmt. Offensichtlich gibt es eine Vielzahl von Transkriptions-Startpunkten für czc, die erkennbaren Promotor-Strukturen passen aber nicht zu gängigen Consensus-Sequenzen. Gerade sollen die Promotor-Regionen mit gereinigten CzcR- und Czcl-Proteinen auf Protein-Bindung untersucht werden, um die Promotoren und Operatoren von czc aufzufinden.
 Finanzierung: Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt, jetzt Graduiertenkolleg
 Laufzeit: 1997 bis 2000


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Dietrich H. Nies
 Thema: Protonenfluß und Energiekopplung bei einem bakteriellen Kationen-Protonen-Antiporter
 Kurzbeschreibung: Ein Gram-negatives Bodenbakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, vermag sich auch in stark mit Schwermetallen belasteten Böden gut zu vermehren. Das Bakterium entgiftet Metalle wie die Ionen Zink, Kobalt, Cadmium und Nickel durch Export. Eine membrangebundene Efflux-Pumpe transportiert sie über die gesamte Zellhülle hinweg nach außen. Motor dieser Pumpe ist der CzcA-Kationen/Protonen-Antiporter. CzcA wurde als LacZ-Fusionsprotein gereinigt, jedoch nicht bis zur Homogenität. Zur Zeit werden biochemische Meßsysteme für dieses Protein aufgebaut, um die Funktion von CzcA weiter zu charakterisieren. Durch gerichtete Mutagene wurden Aminosäuren, die zwischen CzcA und verwandten Proteinen konserviert sind, oder die potentielle Metall-Bindestellen darstellen, gegen andere, strukturell ähnliche Aminosäuren ausgetauscht. Dabei wurden die ersten absolut essentiellen Aminosäuren in CzcA identifiziert. Eine dieser Aminosäuren ist Glutamat-415. Diese Aminosäure ist bei etwa zwei Dutzend der mit CzcA verwandten Proteinen der RND-Familie konserviert. Der Austausch E415Q zu Glutamin führt zu einem völlig inaktiven Protein, aber selbst die Erhaltung der Ladung im Mutanten-Protein E415D stört die Funktion. Da die recht geringfügige Änderung der Position einer Carboxylgruppe auf den Transport der großen Schwermetall-Kationen keinen Einfluß haben sollte, jedoch ein Ladungs-Relais-System für Protonen von der korrekten Position der einzelnen Ladungsträger abhängig ist, postulieren wir, daß wir eine für den Protonen-Transport essentielle Aminosäuren identifiziert haben.
 Finanzierung: Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt, Verbundprojekte
 Laufzeit: 1996 bis 1998


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Dietrich H. Nies
 Thema: Aufbau eines biochemischen Meßsystems für das ChrA-Protein und Derivate dieses Proteins
 Kurzbeschreibung: Ein Gram-negatives Bodenbakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, vermag sich auch in stark mit Schwermetallen belasteten Böden gut zu vermehren. Das Bakterium entgiftet Metalle wie die Ionen von Zink, Kobalt, Cadmium und Nickel durch Export. Chromat, Cr(VI),wird ebenfalls beim Vorhandensein der induzierbaren chr Resistenz-Determinante verringert in der Zelle akkumuliert. Es hat sich im letzten Jahr gezeigt, daß Chromat jedoch nicht nur durch Efflux über den ChrA-Transporter entgiftet wird. Chromat wird auch in den Zellen reduziert, wobei eine Anzucht der Zellen unter Sulfat-Mangel nicht nur die Aufnahme von Chromat durch Sulfat-Aufnahme-Systeme induziert, sondern auch eine verstärkte Reduktion bewirkt, wahrscheinlich zu Cr(III). Weitere Gene, die die chr-Determinante flankieren, sind ebenfalls im Chromat-Stoffwechsel involviert. Das Cnr-System, das die divalenten Kationen Ni(II) und Co(II) entgiftet, wird auf der Ebene der Transkription durch Chromat induziert und könnte das divalente Cr(II)-Kation durch Efflux entgiften. Ein Protein mit Ähnlichkeit zu Superoxid-Dismutasen wird direkt stromabwärts von chr kodiert. Dies Protein könnte eine Chromoxid-Dismutase sein. Weitere Gene kodieren einen ABC-Transporter für Oxyanionen und einen Hitzeschock-Sigma-Faktor. Um dieses komplexe System aufzuklären, soll zunächst die Funktion von ChrA, dem Chromat-Transporter untersucht werden.
 Finanzierung: Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt, Fortsetzung beantragt im Graduiertenkolleg "Transport"
 Laufzeit: bis 1997


 Projektleiter: Prof. Dr.rer.nat.habil. Dietrich H. Nies
 Thema: Transport essentieller, aber toxischer Schwermetall-Kationen innerhalb der Pflanzenzelle
 Kurzbeschreibung: Das CzcD-Protein ist in der Regulation der Kobalt-, Zink- und Cadmium-Resistenz von A. eutrophus involviert. In den letzten Jahren wurden immer mehr Proteine gefunden, die mit CzcD verwandt sind und die vielleicht alle transportierende Regulatoren sind. So hat die Bäckerhefe zwei dieser Proteine, Menschen haben drei. Um die Funktion dieser Proteine in komplexen Systemen zu verstehen, sollen CzcD-verwandte Proteine in Pflanzen gesucht und charakterisiert werden. Es wurden zu diesem Zweck die beiden Gene aus der Bäckerhefe, die CzcD-homologe Proteine kodieren, kloniert. Durch gerichtete Mutagenese wurden sie in der Hefe ausgeschaltet, um ein eukaryontisches Modell-System für die Charakterisierung der Pflanzengene zu schaffen. Da die beiden Hefegene sich im Laufe der Evolution stark spezialisiert haben, wurde aus einer Schwermetall-resistenten Hefe in Zusammenarbeit mit Dr. Kunze (IPK Gatersleben) ein drittes Hefe-Gen kloniert. Mit diesen Genen als Sonde wurden CzcD-homologe Gene in Tabak, Tomate und der Schwermetall-resistenten Pflanze Silene nachgewiesen und teilweise auch bereits in Zusammenarbeit mit anderen Arbeitsgruppen des SFB kloniert.
 Finanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 63 "Mol. Zellbiol. pflanzl. Systeme"
 Laufzeit: 1996 bis 1998


 Projektleiter: Dr.Ing. Erhard Jöx, Prof. Dr. Jan R. Andreesen
 Thema: Isolierung, Identifizierung und Untersuchungen zu Cholesterolabbau und Cholesteroloxidase-Aktivität von verschiedenen Rhodococcus-Stämmen
 Kurzbeschreibung: Die Zielstellung des Projektes bestand darin, cholesterolabbauende Mikroorganismen aus Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs zu isolieren. Aus Anreicherungskulturen mit Cholesterol als einziger Kohlenstoffquelle wurden 30 Isolate erhalten, die in der Lage waren, Cholesterol abzubauen. Die 2 Isolate mit der größten Cholestrolabbauleistung wurden näher charakterisiert und als Rhodococcus erythropolis-Stämme identifiziert. Beide Rhodococcus-Stämme waren unter optimierten Bedingungen in der Lage, das im Medium enthaltene Cholesterol (1 g/l) innerhalb von 2 Tagen vollständig zu verwerten. Die extrazellulären Cholesteroloxidase-Aktivitäten erreichten dabei Werte zwischen 60 und 80 . 10-3 U/ml. Die Analyse der Transformationsprodukte des Cholesterols mittels HPTLC ergab, daß von beiden Stämmen aus Cholestrol 4-Cholesten-3-on gebildet wird. Dieses Produkt wurde weiter verstoffwechselt, wobei keine weiteren Intermediate nachweisbar waren.Daher sollten beide Stämme in der Lage sein, Cholesterol vollständig zu Kohlendioxid und Wasser abzubauen. Auch als Batch-Kultur im Fermenter erfolgte ein vollständiger Abbau des Cholesterols innerhalb von 2 Tagen. Nach der Lyophilisation mit Magermilch als Kryoprotektor wurde für Stamm 11,3 eine Überlebensrate von 43 % und für Stamm 28 von 74 % ermittelt. Aufgrund der hohen extrazellulären Cholesteroloxidase-Aktivität sind beide Stämme für eine entsprechende Enzymproduktion für analytische Zwecke geeignet. Das Projekt wurde 1995 mit diesem Stand der Untersuchungen abgeschlossen.
 Finanzierung: Haushalt
 Laufzeit: 1993 bis 1995


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