Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Forschungsbericht Berichtszeitraum:01.01.99 - 31.12.00

Fachbereich Biologie

Institut für Pflanzenphysiologie

Projekte


Projektleiter:

Prof. Dr. Ralf Bernd Klösgen

Thema:

Funktionelle Analyse des Proteintransports über die Thylakoidmembran

Kurzbeschreibung:

Die Integration von Proteinen in die Thylakoidmembran, bzw. ihre Translokation über diese Membran, kann auf mindestens vier eigenständigen Wegen erfolgen, die sich in ihrem Mechanismus unterscheiden und selektiv jeweils nur einen Teil der Thylakoidproteine transportieren können. Die Analysen solcher Transportmechanismen stellten einen wesentlichen Forschungsschwerpunkt des vorliegenden Teilprojektes in den letzten Jahren dar. Darüberhinaus haben wir uns mit dem Aufbau der beteiligten Transportapparate beschäftigt und konnten einige der beteiligten Komponenten isolieren. In der kommenden Antragsperiode soll der Schwerpunkt neben der weiteren Charakterisierung dieser Transportmaschinerien vor allem in der funktionellen Analyse des plastidären Proteintransports liegen. Im einzelnen sollen im Rahmen dieser Zielsetzung folgende Aspekte bearbeitet werden:

1. Die Isolierung weiterer Komponenten der Sec- und ?pH-Transportapparate soll vor allem durch zwei Ansätze verfolgt werden. Einerseits durch die Verwendung heterologer Sonden und degenerierter Oligonukleotide, die aus der Sequenz von Transportfaktoren anderer Systeme abgeleitet werden können, und andererseits durch die biochemische Isolierung vollständiger Translokationskomplexe aus der Thylakoidmembran, in denen Translokationsintermediate angereichert wurden. 

2. Interaktionen zwischen zu transportierenden Vorläuferproteinen und Komponenten der plastidären Transportapparate sollen unter Verwendung des heterologen two hybrid-Systems der Hefe direkt nachgewiesen werden. Nach Etablierung des Systems mit dem SecA-Protein einerseits und Sec-abhängig transportierten Proteinen andererseits sollen die an der Interaktion beteiligten Domänen mittels in vitro Mutagenese der jeweiligen Proteinpartner charakterisiert werden. Dieser Versuchsansatz soll bei Erfolg auf andere Transportfaktoren ausgedehnt werden und schließlich auch zur Sichtung von cDNA-Banken dienen, um so weitere, bislang noch unbekannte Transportfaktoren zu identifizieren. 

3. Ein weiterer Schwerpunkt des Projekts in der kommenden Antragsperiode soll es sein, Pflanzen mit Mutationen in einem der Transportfaktoren zu identifizieren, um so mit Hilfe des Phänotyps der Mutante Aufschluß über die Funktion des entsprechenden Proteins zu bekommen. Dazu soll in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Andy Pereira in den Niederlanden eine Kollektion von getaggten Arabidopsismutanten, bei denen ein transponierbares Element an verschiedenen Stellen im Genom integriert ist (gene machine), mit Hilfe unserer Sonden gesichtet werden. Erste Pilotexperimente führten dabei bereits zur Identifizierung einer putativen secY-Mutante. 

4. Als komplementierendes in vivo-System zur Funktionsanalyse der Transportproteine ist das Cyanobakterium Synechocystis 6803 vorgesehen, dessen Genom vor einigen Jahren vollständig aufgeklärt werden konnte. In diesem fakultativ photoautotrophen Prokaryonten ist es möglich, Gene gezielt durch homologe Rekombination auszuschalten und so knock out-Mutanten für die Funktionsanalyse zu erhalten. Dieser Ansatz, der in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Sergey Shestakov von der Universität Moskau verfolgt wird, wurde kürzlich bereits mit einigen Genen der cyanobakteriellen Proteintransportmaschinerie durchgeführt. Derzeit befinden sich diese Mutanten in der Segregationsanalyse. 

5. Die Phylogenie des pH-abhängigen Thylakoidtransports soll am Beispiel des Rieske Fe/S-Proteins genauer analysiert werden. Der Vergleich der plastidären und cyanobakteriellen Rieske-Proteine legt nahe, daß es im Zusammenhang mit dem Gentransfer in den Kern zu einer Verschlechterung des Thylakoidtransportsignals und dadurch zu einer merklichen Retardierung des Proteins im Stroma gekommen ist. Die Ursache dafür könnte der Einbau der Fe/S-Gruppe in das Protein sein, von dem angenommen wird, daß er im Stroma stattfindet, was den Membrantransfer eines zumindest partiell gefalteten Proteins bedingen würde. Diese Hypothese soll durch die Analyse geeigneter mutierter Rieske-Proteine überprüft werden. 

6. Auch der Mechanismus der spontanen Membranintegration der kerncodierten Untereinheit CFo-II der plastidären ATP Synthase hat offenbar einen ungewöhnlichen phylogenetischen Ursprung. Wie die Analyse des plastomcodierten Schwesterproteins CFo-I zeigt, ist es durch den Transfer des atpG-Gens in den Kern offenbar zu einem Rearrangement der Integrationssignale in CFo-II gekommen, die letztlich zu einem neuen Transportmechanismus geführt haben. Mit Hilfe rekombinanter Polypeptide und unter Einbeziehung auch der zu CFo-I und CFo-II homologen cyanobakteriellen Proteine soll versucht werden, diese Prozesse in vitro, nach Transformation von Pflanzen aber auch in vivo, nachzuvollziehen. 

7. Das green fluorescent protein (GFP) soll als Markerprotein für die Plastidenentwicklung etabliert werden. Unsere bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, daß es nach Fusion an geeignete Transitpeptide ins Thylakoidlumen transportiert werden kann. Da GFP nur bei neutralem, nicht jedoch bei saurem pH (< pH 5) fluoresziert, soll versucht werden, mit seiner Hilfe ein in vivo-Meßsystem in transgenen Pflanzen zu etablieren. So sollte es beispielsweise nach Transformation von Arabidopsis thaliana mit geeigneten Genkonstruktionen möglich sein, den thylakoidalen pH-Wert bei verschiedenen Lichtbedingungen nachzuvollziehen. Darüberhinaus sollte sich auf diese Weise auch überprüfen lassen, ob Restthylakoide bzw. Thylakoidvorläufer in photosynthetisch inaktiven Plastidentypen einen Protonengradienten aufbauen. 

Partner:

 

Finanzierung:

Sonderforschungsbereich 363

Laufzeit:

1999-2001


 Projektleiter:

Prof. Dr. Ralf Bernd Klösgen

 Thema:

Phylogenie des TAT-Transports: Der ?pH-abhängige Transport von RR-Proteinen über die Thylakoidmembran in Chloroplasten

 Kurzbeschreibung:

Der ?pH-abhängige Proteintransport über die Thylakoidmembran in Chloroplasten und der bakterielle TAT-Weg haben vermutlich einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung, der im Rahmen eines Paketantrags von vier Arbeitsgruppen komplementierend analysiert werden soll. Dabei sind von uns folgende Experimente vorgesehen: (1) Es soll mit Hilfe zweier authentischer TAT-Substrate, GFOR aus Zymomonas mobilis sowie des plastidären Rieske Fe/S-Proteins, untersucht werden, ob die Proteine in gefalteter Form, d.h. zusammen mit ihren Cofaktoren, über die Thylakoidmembran transloziert werden können. (2) Die Rolle des allgemein als essentiell angesehenen Zwillings-Arginin (RR)-Motivs in den plastidären ?pH (TAT)-Transportsignalen soll durch den Vergleich des plastidären mit dem cyanobakteriellen Rieske-Protein genauer untersucht werden, da Sequenzvergleiche zeigen, daß in diesem Protein das Motiv während der Plastidenentwicklung scheinbar "verschlechtert" wurde (RR zu KR). Fusionen mit fremden TAT-Transportsignalen sollen darüberhinaus den Einfluß der hydrophilen, Cofaktor-bindenden Domäne des Rieske-Proteins beim Thylakoidtransport aufklären. (3) Die "Versiegelung" der Membran während des Proteintransports soll mit Hilfe von Thylakoidvesikeln untersucht werden, die das green fluorescent protein akkumuliert haben. (4) Nach Etablierung eines zum in thylakoido-Transport analogen bakteriellen in vitro TAT-Transportsystems (AG Müller, Freiburg) soll durch wechselseitigen Austausch einzelner Transportkomponenten versucht werden, chimäre Transportsysteme mit möglicherweise neuen Mechanismen bzw. Spezifitäten zu entwickeln.

 Partner:

PD Dr. Georg Sprenger (FZ Jülich), Prof. Dr. Roland Freudl (FZ Jülich), Prof. Dr. Matthias Müller (Uni Freiburg), Dr. Andreas Seidler (Uni Bochum)

 Finanzierung:

DFG

 Laufzeit:

2000-2002


Projektleiter:

Prof. Dr. Klaus Humbeck

Thema:

Die Rolle von Metallothioneinen während der Schwermetall-induzierten Blattseneszenz

Kurzbeschreibung:

Chloroplasten enthalten eine Reihe von Metallen wie z. B. Kupfer (Plastocyanin), Mangan (wasserspaltender Komplex) und Magnesium (Chlorophyll). Über die Ausbildung einer Schwermetallhomöostase in Plastiden ist nur wenig bekannt. Während der Blattseneszenz werden die inkorporierten Schwermetalle freigesetzt und zumindest teilweise in andere Pflanzenteile transportiert. Zum einen werden durch Schwermetall-Applikation der Seneszenz ähnelnde Abbauprozesse in den Plastiden isoliert. Zum anderen ist bekannt, dass Metallothionein-Gene mit Beginn der natürlichen Blattseneszenz induziert werden. In dem Projekt wird die Rolle der Metallothioneine in schwermetallinduzierter und natürlicher Seneszenz untersucht. Ein Schwerpunkt bildet dabei die Untersuchung der Freisetzung von Kupfer aus Plastocyanin und die Induktion und Lokalisation der Metallothioneine auf RNA- und Protein-Ebene. Weitere mögliche Kupfer-bindende Komponenten („Cupper Chaperon like Proteins“) werden ebenfalls analysiert. Änderungen in der Genexpression während natürlicher und schwermetallinduzierter Seneszenz werden mittels RFDD-PCR verglichen.

Partner:

Dr. Jürgen Miersch, FB Biochemie-Biotechnologie

Finanzierung:

DFG

Laufzeit:

2000-2003


 Projektleiter:

Prof. Dr. Stefanie Neumann

 Thema:

Zuckertransport und –metabolismus während der Etablierung des vegetativen sinks Cuscuta bei der Parasitierung Höherer Pflanzen. 

 Kurzbeschreibung:

Cuscuta ist ein Pflanzenparasit, der insbesondere in mediterreanen und subtropischen Ländern große wirtschaftliche Schäden verursacht. Nach Infektion entwickelt sich Cuscuta zu einem sehr starken sink. Genaue Kenntnisse über dessen Ausbildung könnten einerseits Aufschlüsse über Strategien der sink-Stärke-Beeinflussung in Ernteorganen von Nutzpflanzen liefern und andererseits Möglichkeiten einer effektiven Bekämpfung des Parasiten eröffnen.

Ziel der geplanten Untersuchungen ist es, den Transfer von Saccharose als Haupttransportform der Assimilate im Wirt-Parasit-System Vicia faba-Cuscuta reflexa zu untersuchen und die stoffwechselphysiologischen Vorgänge bei der Ausbildung und der Regulation des durch Cuscuta induzierten sinks zu charkterisieren. Dazu sollen die an diesem Prozeß beteiligten Enzyme (u.a. Invertasen, Saccharose-Synthase, Saccharosephosphat-Synthetase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Amylasen, Stärkephosphorylase) sowie Zucker- und Aminosäuretransporter, einschließlich funktionell gekoppelter ATPasen, während verschiedener Phasen der Haustorienentwicklung auf physiologischer und molekularer Ebene untersucht werden. Parallel dazu sollen die Verteilungsmuster endogener Phytohormone in verschiedenen Entwicklungsstadien des Haustoriums in spezifischen Geweben von Wirt und Parasit bestimmt werden, um Einsicht in die hormonelle Regulation der strukturellen und physiologischen Prozesse zu erhalten.

 Partner:

Prof. Dr. U. Wobus Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben

 Finanzierung:

Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt, 

 Laufzeit:

1999 - 2002


 Projektleiter:

Prof. Dr. Udo Johanningmeier

 Thema:

Plastidäre Proteasen und Photosystem II-Stabilität 

 Kurzbeschreibung:

Chloroplasten sind in der Lage, über noch unbekannte Proteasen defekte oder abnorme Proteine zu erkennen und abzubauen. Das Ziel des Projektes ist die Identifizierung plastidärer Proteasen, die generell an der Entfernung defekter Proteine des Chloroplasten beteiligt sind und potentiell auch eine Rolle im "turnover"-Prozeß des D1-Proteins spielen können. 

 Finanzierung:

DFG

 Laufzeit:

1995 - 1999


Weitere Informationen zu Institut für Pflanzenphysiologie :


Zurück zu