Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Forschungsbericht Berichtszeitraum:01.01.99 - 31.12.00

Fachbereich Biologie

Institut für Mikrobiologie

Projekte


 Projektleiter:

Dr. Ute Lechner, Prof. Dr. Jan R. Andreesen

 Thema:

Reduktive Dechlorierung von Chloraromaten durch anaerobe Bakterien und deren Anpassung an Umweltbedingungen

 Kurzbeschreibung:

Hochchlorierte aromatische Verbindungen sind durch eine hohe Persistenz in der Umwelt gekennzeichnet. Für einige Verbindungen ist die reduktive Dechlorierung durch anaerobe Bakterien der einizige bisher bekannte biologische Abbaumechanismus. Aus Sedimenten der Saale, Mulde und des hoch mit chlororganischen Verbindungen belasteten Spittelwassers (Bitterfeld) wurden anaerobe Konsortien angereichert und charakterisiert, die verschiedene Chloraromaten (Chlordibenzo-p-dioxine, Chlorphenole) reduktiv dechlorieren können. Anhand ausgewählter Kongenere wurden die Dechlorierungswege für polychlorierte Dibenzo-p-dioxine aufgeklärt und Unterschiede zwischen den Anreicherungen unterschiedlicher Herkunft aufgezeigt. Durch molekularbiologische Methoden (Fluoreszens-in situ-Hybridisierung mit art- und gruppenspezifischen Oligonukleotidsonden, gegen die 16S rDNA gerichtete "Nested"-PCR-Ansätze und Dot-Blot-Hybridisierungen) wurden Mitglieder der dehalogenierenden Gattungen Dehalococcoides, Desulfitobacterium, Desulfuromonas und Dehalobacter nachgewiesen, wobei die Zahl der als Dehalococcoides identifizierten Bakterien mit der Anzahl der dehalogenierenden Zellen korrelierte. Eine aus Saalesediment angereicherte Mischkultur war in der Lage, mit 2,4,6-Trichlorphenol als Elektronenakzeptor und Formiat als Elektronendonator zu wachsen, was auf die Nutzung der Dehalorespiration als energiekonservierende Reaktion hindeutet. Desulfitobacterium sp. Stamm TCP-A wurde als dehalogenierender Organismus isoliert und charakterisiert. Der Stamm ist nicht nur in der Lage, die toxischen Chlorphenole als Elektronenakzeptor zu nutzen, sondern kann sich auch durch eine starke Veränderlichkeit der Zusammensetzung der Fettsäuren in der Cytoplasmamembran an die toxischen Substrate anpassen. Die Primärstruktur der Gene, die für die 16S rRNA kodieren, wurde in verschiedenen Arten der Gattung Desulfitobacterium untersucht. Im Gegensatz zu der bekannten Konserviertheit von 16S rRNA-Genen, konnte für diese Gattung eine hohe Mikroheterogenität von multiplen Genen nachgewiesen werden, die durch Insertionen von ca. 60 bis 100 Basen charakterisiert ist und deren Funktion bisher nicht bekannt ist.

 Finanzierung:

Umweltministerium Land Sachsen-Anhalt, Graduiertenkolleg "Adaptive physiologisch-biochemische Reaktionen auf ökologisch relevante Wirkstoffe 

 Laufzeit:

1998-2001, 2000-2002


 

 Projektleiter:

Dr. Brigitte Söhling, Prof. Dr. Jan R. Andreesen

 Thema:

Bildung von Acetyl-Phosphat aus Carboxymethyl-Selenoprotein A bei der Glycin-Reduktion

 Kurzbeschreibung:

Im Rahmen des Projekts wird die reduktive Desaminierung von Glycin bzw. den N-Methylderivaten Sarcosin und Betain durch Eubacterium acidaminophilum und andere anaerobe Mikroorganismen Clostridium sticklandii untersucht. Diese Reaktion wird durch eine redoxaktive Interaktion mehrerer Proteinkomplexe katalysiert, an der verschiedene Thiol- bzw.Selenogruppen beteiligt sind (Proteine A, B, C des Reduktase-Systems, Thioredoxin, Thioredoxin-Reduktase). Nach Bindung des Substrats durch Selenoprotein B (für Glycin und Sarcosin wird eine proteingebundene Carbonylgruppe, vermutlich ein Pyruvoylrest, postuliert) und Desaminierung kommt es dann zur Übertragung (bzw. Bildung) eines Carboxylmethylselenoethers an Selenoprotein A. Anschließend erfolgt die Dehydratisierung des Carboxymethylselenoethers zum enzymgebundenen Acetylthioesters (Protein C), der durch weitere Umsetzung über die Zwischenstufe Acetylphosphat zur Energiekonservierung genutzt werden kann. Die bisherigen biochemischen und molekularbiologischen Arbeiten im Rahmen eines DFG-Schwerpunktprogramms konzentrierten sich im wesentlichen auf die Charakterisierung von Selenoprotein A und B. Der letzte Schritt der Reaktion, die Bildung eines Acetyl-Thioesters aus einem Carboxymethylselenoethers durch Protein C ist bisher katalytisch völlig unverstanden. Über die unphysiologische "Nebenreaktion" der Hydrolyse von Acetylphosphat in Gegenwart von Arsenat konnte das Enzym gereinigt werden. Nun liegen uns die Gene für beide Untereinheiten vor, und wir wollen die Rolle der beiden Untereinheiten in der physiologischen Reaktion (Carboxymethylselenoether Acetylthioester Acetylphosphoester) nun durch heterologe Überexpression der Untereinheiten in E. coli und gerichtete Mutagenese untersuchen. 

 Finanzierung:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

 Laufzeit:

1999 -2001 (2002)


 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Brigitte Söhling

 Thema:

Mechanismus der UGA Decodierung als Selenocystein in Gram-positiven anaeroben Bakterien

 Kurzbeschreibung:

Die 21. Aminosäure Selenocystein ist essentieller Bestandteil vieler jetzt bekannter Enzymsysteme, und kommt in allen biologischen Reichen vor. Anaerobe Gram-positive Mikroorganismen, die Aminosäuren verwerten, zeichnen sich durch den Besitz einer Vielzahl verschiedener Selenoproteine wie z. B. Glycin-Sarcosin- und Betain-Reduktasen, Formiat-Dehydrogenasen, Selenophosphat-Synthetasen, u. a. aus. Zu diesen Aminosäureverwertern gehören neben apathogenen Bakterien wie dem in der Arbeitsgruppe bearbeiteten Eubacterium acidaminophilum auch pathogene Organismen, wie z. B. Clostridium difficile. Während des cotranslationalen Einbaus von Selenocystein in bakterielle Proteine wird eine spezielle mRNA Sekundärstruktur (SECIS, selenocysteine-insertion sequence) von einem besonderen Elongationsfaktor SeLB erkannt, wodurch es zum Einbau von Selenocystein am UGA codon, das normalerweise als Stopcodon gelesen wird, erfolgt. Das konservierte SECIS-Element liegt in Escherichia coli direkt stromabwärts des UGA-Codons und somit innerhalb der codierten Region. Der Gram-positive anaerobe Organismus E. acidaminophilum besitzt die vier sel-Gene und hat mindestens 6 Selenoproteine unterschiedlicher Funktion. Die Verwirklichung eines konservierten SECIS-Elements in der codierten Genregion, das nach Erkennung durch SeLB den Einbau von Selenocystein ermöglicht, ist daher schwierig, und ein gemeinsames SECIS-Motiv wie es für E. coli beschrieben ist, fehlt, obwohl verschiedenste Sekundärstrukturen formuliert werden können.Im Rahmen des Projekts sollen mögliche SECIS-Elemente in diesenmRNAs, die den Selenocystein-Einbau dirigieren, anhand ihrer Interaktion mit dem SeLB aus E. acidaminophilum durch in vitro Studien identifiziert und charakterisiert werden. Ihre Funktion bei der Selenocystein-Decodierung soll in vivo durch heterologe Expression von SECIS-lacZ-Fusionen in E. coli in Gegenwart von E. acidaminophilum SeLB untersucht werden.

 Finanzierung:

Deutsche Forschungsgemeinschaft 

 Laufzeit:

1999 bis 2001

 


 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Brigitte Söhling

 Thema:

Charakterisierung eines selenhaltigen Peroxidase-Reduktase Systems des strikt anaeroben Bakteriums Eubacterium acidaminophilum

 Kurzbeschreibung:

E. acidaminophilum exprimiert ein 22 kDa Selenoprotein, das nach N-terminaler Sequenzierung als zugehörig zur Familie der Peroxiredoxine eingeordnet werden kann. Antioxidative Proteine dieser Familie wurden erst vor ca. 10 Jahren entdeckt und nun in allen biologischen Reichen, in Bacteria, Archaea, in Pflanze, Tier und Mensch nachgewiesen. Sie katalysieren die Reduktion von Peroxiden in einer Thiol-abhängigen Reaktion. Das Vorkommen solcher Proteine auch in anaeroben Bakterien wurde lange unterschätzt, jedoch muß gerade bei diesen empfindlichen Organismen ein zuverlässiges System vorhanden sein, das ständig dafür sorgt, daß bei einem zufälligen Kontakt mit Sauerstoff und dessen reaktiven Derivaten diese abbaut. Ziel des Projekts ist die Charakterisierung des Peroxidase-Systems einschließlich des Elektronenüberträgers in vivo. Dazu werden biochemische Methoden (Reinigung des Peroxiredoxins und des Elektronendonors) und molekularbiologische Methoden (Klonierung und Analyse der entsprechenden Genregion) eingesetzt. Das Vorkommen eines Selenocysteinrestes anstelle des sonst katalytisch essentiellen Cysteins im Protein von E. acidaminophilum erinnert an die eukaryontische Glutathion-Peroxidase, jedoch bestehen trotz ähnlicher Katalyse keine Sequenzhomologien. 

 Finanzierung:

Innovationskolleg der Deutsche Forschungsgemeinschaft "Redoxkotrolle bei der Zellspezialisierung" 

 Laufzeit:

1998 bis 2000

 


 

 Projektleiter:

Dr. Andreas Pich, Prof. Dr. Jan R. Andreesen

 Thema:

Funktion von Pyruvylenzymen in anaeroben Bakterien

 Kurzbeschreibung:

Die D-Prolin-Reduktase aus Clostridium sticklandii gehört mit der Glycin- und der Sarcosin-Reduktase zu einer neuen Klasse von Pyruvylenzymen, deren katalytisch aktive Pyruvylgruppe aus einem Proprotein durch Cysteinolyse gebildet wird. Die Proproteine der Glycin- und Prolin-Reduktase wurden in Escherichia coli überexprimiert und ein in vitro System entwickelt, womit sie in die entsprechenden Untereinheiten gespalten werden konnten. Ein Cysteinrest wird zur Pyruvylgruppe umgewandelt. Wurde dieses Cystein durch Serin oder Threonin ersetzt, konnte die Spaltung des Proproteins ebenfalls beobachtet werden, wurde ein Alanin in die entsprechende Position mutiert, konnte keine Spaltung nachgewiesen werden, so dass die SH- bzw. OH-Gruppe eine wichtige Funktion bei der Spaltung hat. Das gesamte Operon und die angrenzenden DNA-Bereiche der D-Prolin-Reduktase wurde kloniert und sequenziert. Das Operon wird von einen 54-abhängigen Promotor aus transkribiert. Stromaufwärts der Gene für die D-Prolin-Reduktase konnte ein Gen für ein 54 Aktivatorproteine identifiziert werden. Das entsprechende Protein wurde in Rohextrakten aufgrund seiner Homologien zu NifA immunologisch nachgewiesen.

 Finanzierung:

Deutschen Forschungsgemeinschaft

 Laufzeit:

1999 bis 2003



 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Andreas Pich

 Thema:

Wolframat-Aufnahme Gram-positiven anaeroben Bakterien 

 Kurzbeschreibung:

Die Enzyme Aldehyde-Oxidoreduktase (AOR) und Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus Eubacterium acidaminophilum enthalten Wolfram als katalytisch aktives Metall. Wolfram liegt im Ökosystem als Wolframat vor und wird durch einen ABC-Transporter von E. acidaminophilum aufgenommen. Die Gene für diesen Transporter konnten kloniert und sequenziert werden (tupABC). Sie befinden sich in direkter Nachbarschaft zu den Genen, die die Wolfram-abhängige FDH kodieren und zu Genen, deren Genprodukte an der Biosynthese des Pterin-Kofaktors beteiligt sind. Sie werden jedoch separat transkribiert. Das Bindeprotein des Wolframat-Transporters wurde in Escherichia coli überexprimiert und biochemisch charakterisiert. Eine sehr hohe Spezifität für Wolframat konnte nachgewiesen werden (Kd = 0,5 µM). Molybdat wurde nur gebunden, wenn es im 1000-fachen Überschuss angeboten wurde. Somit zeichnet sich dieses Transportsystem gegenüber Molybdat-Transportsystemen aus E. coli und Azotobacter vinelandii aus, die zwischen Molybdat und Wolframat nicht unterscheiden können, In Archaea und den Gram-negativen Pathogenen Vibrio cholerae und Campylobacter jejunii konnten hoch homologe Transportsysteme nachgewiesen werden.

 Finanzierung:

Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt

 Laufzeit:

1999 bis 2002 


 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder

 Thema:

Untersuchungen zum mikrobiellen Abbau von Morpholin

 Kurzbeschreibung:

Der xenobiotische Heterocyclus Morpholin findet in der chemischen Industrie ein breites Anwendungsspektrum. Er gelangt dementsprechend in größeren Mengen in die Umwelt, wo er nach seiner Umwandlung zum Nitrosamin carcinogen wirken kann. Wir konnten ein als Mycobacterium gilvum identifiziertes Bakterium in Reinkultur isolieren, das in der Lage ist, Morpholin (bis zu 100 mM) als alleinige C- , N- und Energie-Quelle zu nutzen. Damit besitzt es eine wesentliche Voraussetzung für einen in situ Einsatz. Beim Wachstum auf Morpholin wird eine Alanin Dehdrogenase induziert, die möglicherweise für die Entgiftung der NH4+-Ionen nötigt ist. Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß das einleitende Enzym des Morpholinabbaus eine P450-abhängige Monooxygenase ist. Zwei Komponenten dieses Enzyms wurden bis zur Homogenität gereinigt und werden derzeit auf molekularbiologischer Ebene analysiert.

 Finanzierung:

Graduiertenförderung der Universität Halle

 Laufzeit:

1999 bis 2001


 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder

 Thema:

Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung der Tetrahydrofuranumsetzenden Enzyme aus Pseudonocardia sp.

 Kurzbeschreibung:

Der zyklischen Ether Tetrahydrofuran (THF) wird in der Industrie häufig als Lösungsmittel verwendet und kann in der Umwelt zu ernsthaften Schädigungen der Biosphäre führen. Wir konnten einen als Pseudonocardia sp. identifizierten Stamm isolieren, der THF (bis 50 mM) als alleinige C- und Energiequelle nutzen kann. Untersuchungen zur Biochemie des Abbaus zeigten, daß der initiale Oxidationsschritt von einer Multikomponenten Monooxygenase katalysiert wird. Dieses Enzym besitzt ein kovalent gebundenes Flavin in der Reduktase Komponente und im katalytischen Zentrum der Oxygenase Komponente ein binukleares Eisen. Die molekularbiologische Analyse zeigte, daß in Nachbarschaft zu der Oxygenase weiter Enzyme des THF-Abbaus kodiert sind. Im Rahmen des Projekts soll sowohl die initiale Oxygenase als auch die weiteren Enzyme des THF-Abbaus eingehend charakterisiert werden.

 Finanzierung:

DFG-Graduiertenkolleg; Stipendium

 Laufzeit:

2000 bis 2003


 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Jan R. Andreesen, Dr. Thomas Schräder

 Thema:

Enzymkatalyse der flavinabhängigen Pyrrol-2-carboxylat Monooxygenasen aus Arthrobacter sp. und Rhodococcus sp.

 Kurzbeschreibung:

Der aerobe Abbau von Pyrrol-2-carboxylat wird bei den Gram-positiven Bakterien Arthrobacter sp. und Rhodococcus sp. durch eine Hydroxylierung des Substrats zum 5-OH-Pyrrol-2-carboxylat eingeleitet. Diese NADH- und Sauerstoff-abhängige Reaktion wird jeweils von einer flavinabhängigen Monooxygenase katalysiert, die als einzigen Redox-Kofaktor ein FAD besitzt, das direkt an der Substrathydroxylierung beteiligt ist. Bei Arthrobacter sp. wird diese Reaktion von einem Einkomponenten Enzym (60 kDa), bei Rhodococcus sp. von einem Zweikomponenten Enzym katalysiert (54 und 18,7 kDa). Damit gehört letzteres zur kürzlich gefundenen Klasse der flavinabhängigen Zweikomponenten Monooxygenasen. Die vorliegenden Daten für diese Enzyme deuten darauf hin, daß die Art der FAD-Bindung, der Elektronenfluß und damit auch die Enzymkatalyse von der der "klassischen" flavinabhängigen Einkomponenten Monooxygenasen abweicht. In dem beantragten Projekt soll die Funktion der Komponenten der beiden Pyrrol-2-carboxylat Monooxygenasen bei der Enzymkatalyse vergleichend untersucht werden. Nach Aufkärung der Primärstruktur beider Enzyme soll durch molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie kinetische und spektroskopische Analysen Informationen über das FAD-bindende katalytische Zentrum und den Elektronenfluß bei der Katalyse gewonnen werden.

 Finanzierung:

DFG Einzelantrag 

 Laufzeit:

1999-2001


 Projektleiter:

Prof. Dr. Dietrich H. Nies

 Thema:

Funktion des CzcCB2A-Transporters 

 Kurzbeschreibung:

Wir wollen die genaue Funktion des CzcCB2A-Proteinkomplexes verstehen, der Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutropha) Resistenz gegen die Schwermetalle Co2+, Zn2+ und Cd2+ verleiht. Zwar ist die Lokalisierung der Untereinheiten in der bakteriellen Zellwand und die Funktion des CzcCB2A-Komplexes als Kationen-Protonen-Antiporter bekannt, es ist jedoch unklar, ob es wirklich einen Transport über die gesamte Zellhülle nach außen gibt, ob weitere Proteine beim Transport involviert sind, welche genaue Funktion die drei Untereinheiten erfüllen und wieviel CzcCB2A-Komplex für welche Homöostase-Leistung erforderlich ist. Gelöst werden sollen diese Fragen (1) durch Reinigung der drei Untereinheiten, (2) Studien unter Einsatz von Antikörpern gegen die drei Untereinheiten, (3) Optimierung unseres biochemischen Meßsystems, (4) Rekonstitutionsstudien, und (5) die genaue Bestimmung der Zahl der CzcCB2A-Komplexe pro Zelle unter verschiedenen Bedingungen und deren Auswirkung auf das Gleichgewicht an Schwermetallen. Das Verständnis von CzcCB2A ist auch wichtig, um Transporter der RND-Familie von multiple drug resistance Systemen auch pathogener Bakterien zu verstehen. 

 Finanzierung:

Deutsche Forschungsgemeinschaft

 Laufzeit:

1999 bis 2002


 

 Projektleiter:

Prof. Dr. Dietrich H. Nies

 Thema:

Regulation der Schwermetall-Homöostase in Alcaligenes eutrophus

 Kurzbeschreibung:

Ein Gram-nagatives Bodenbakterium, Alcaligenes eutrophus CH34, vermag sich auch in stark mit Schwermetallen belasteten Böden gut zu vermehren. Das Bakterium entgiftete Metalle wie die Ionen von Zink, Kobalt, Cadmium und Nickel durch Export. Eine membrangebundene Efflux-Pumpe transportiert sie über die gesamte Zellhülle hinweg nach außen. Da besagte Metall-Ion aber auch essentielle Spurenelemente für dieses Bakterium sind, muß ihr Export streng reguliert werden. Die Gene, die die Untereinheiten für die CzcCBA-Effluxpumpe kodieren, werden daher von Genen für regulatorische Proteine eingerahmt. Von drei Proteinen, CzcN, Czcl und Orf69a, kennen wir die Funktion noch nicht, für die der drei anderen (CzcD, CzcS und CzcR) liegen erste Ergebnisse vor. Alle neun Gene werden durch Metalle auf der Ebene der Transkription reguliert, die Größen der mRNAs und ihre Anfänge wurden im letzten Jahr bestimmt. Offensichtlich gibt es eine Vielzahl von Transkriptions-Startpunkten für czc, die erkennbaren Promotor-Strukturen passen aber nicht zu gängigen Consensus-Sequenzen. Gerade sollen die Promotor-Regionen mit gereinigten CzcR- und Czcl-Proteinen auf Protein-Bindung untersucht werden, um die Promotoren und Operatoren von czc aufzufinden. . 

 Finanzierung:

DFG, Graduiertenkolleg "Streß"

 Laufzeit:

2000-2003


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